Erweiterten genetischen Code

Eine erweiterte genetische Code bezieht sich auf eine künstlich modifizierten genetischen Code, in dem ein oder mehrere spezifische Codons bereitgestellt wurden, um eine Aminosäure, die nicht zu den 20 "Standard" Aminosäuren kodieren.

"Standard" oder "natürlich" Aminosäuren sind die 20 proteinogenen alpha-Aminosäuren, die in der Natur sind die Bausteine ​​aller Proteine ​​im Menschen und anderen Eukaryoten, und das auch direkt durch den genetischen Code codiert werden. Alle anderen werden als "Nicht-Standard", "nicht-kanonische" oder "unnatürliche" bekannt.

Im Mai 2014 kündigte die Forscher, und auch einzelne künstliche Nukleotide in den Kulturmedien, dass sie zwei neue künstliche Nukleotide in bakterielle DNA erfolgreich eingeführt hatten, waren in der Lage, die Bakterien Gang 24 Mal; sie nicht erstellen mRNA oder Proteinen in der Lage, die künstliche Nukleotide verwendet werden.

Hintergrund

Die Übersetzung der genetischen Information in Boten-RNA enthalten ist, in einem Protein durch Ribosomen katalysiert. Transfer-RNAs werden als Schlüssel verwendet, um die mRNA in die kodierte Polypeptid zu dekodieren. Die tRNA ein spezifischer drei Nukleotid-Codons in der mRNA mit einer komplementären Sequenz genannt Anticodon auf einer seiner Schlaufen. Jeweils drei Nukleotid-Codon in einem der zwanzig natürlich vorkommenden Aminosäuren translatiert. Es gibt mindestens eine tRNA für jedes Codon, und manchmal mehrere Codons für ein und dieselbe Aminosäure. Viele tRNAs sind mit mehreren Codons kompatibel. Das Enzym eine Aminoacyl-tRNA-Synthetase-kovalent an die Aminosäure an das entsprechende tRNA. Die meisten Zellen eine unterschiedliche Synthetase für jede Aminosäure. Andererseits haben einige Bakterien weniger als 20 Aminoacyl-tRNA-Synthetasen, und die Einführung der "fehlenden" Aminosäure durch Modifikation einer strukturell verwandten Aminosäure durch eine Amidotransferase Enzyms. Anbringen einer Aminosäure an tRNA verwendet Energie von ATP. Die Aminoacyl-tRNA-Synthetase oft kommt das Anticodon, aber einen anderen Teil der tRNA nicht erkennen, was bedeutet, dass, wenn die Anticodon waren zu mutierenden die Codierung dieser Aminosäure zu einer neuen Codon ändern.

Im Ribosom, wird die Information in mRNA in ein spezifisches Aminosäure umgesetzt werden, wenn die mRNA-Codons einstimmt mit dem komplementären Anticodon eines tRNA und die angelegte Aminosäure an eine wachsende Polypeptidkette addiert. Wenn es aus dem Ribosom freigesetzt wird, faltet sich das Polypeptid-Kette in ein funktionierendes Protein.

Einbringen

Es gibt einige Einschränkungen für die tRNA-Synthetase-Codon und wobei unnatürliche Aminosäure in ein Protein eingebaut. Für die erfolgreiche Umsetzung einer neuen Aminosäure, das Codon, auf die die unnatürlichen Aminosäure zugeordnet ist, kann nicht bereits Code für eine der 20 natürlichen Aminosäuren. In der Regel ein Nonsense-Codon oder ein Vier-Basen-Codon verwendet. Zusammen bilden die tRNA, Aminoacyl-tRNA-Synthetase und Codon sind aufgerufen eine orthogonale Set. Die orthogonalen Satz darf nicht mit den endogenen tRNA-Synthetase und setzt Übersprechen, während immer noch funktionskompatibel mit dem Ribosom und anderen Komponenten des Translationsapparates. Das aktive Zentrum der Synthetase wird modifiziert, um nur die nicht-natürliche Aminosäure zu akzeptieren. Am häufigsten wird eine Bibliothek von mutierten Synthetase für eine, die die tRNA mit der gewünschten unnatürlichen Aminosäure auflädt gescreent. Die Synthetase wird ebenfalls modifiziert, um nur die orthogonale tRNA erkennt. Die tRNA-Synthetase-Paar wird oft in anderen Bakterien oder eukaryotischen Zellen entwickelt. Die unnatürliche Aminosäure muss das Zytoplasma durchdringen, wenn sie in das Wachstumsmedium der Zellen hinzugefügt.

Eine ähnliche frühere Konzept ist das der alloprotein, das durch Inkubieren von Zellen mit einer unnatürlichen Aminosäure in der Abwesenheit eines ähnlichen codierte Aminosäure, damit der erstere gemacht werden, um in das Protein anstelle des letzteren eingearbeitet werden, beispielsweise L-2 -Aminohexansäure für Methionin.

Die Möglichkeit der Neuzuordnung Codons wurde durch Normanly et al realisiert. 1990, als eine brauchbare Mutantenstamm von E. coli durch das Amber-Codon zu lesen. Als Ergebnis das Amber-Codon wurde die Wahl Codon, eine neuartige Aminosäure zugeordnet werden. Später, in der Schultz-Labor der tRNATyr / Tyrosyl-tRNA-Synthetase aus Methanococcus jannaschii, einer Archaebakterium, wurde verwendet, um eine Tyrosin anstelle von HALT, der Standardwert des Amber-Codon einzuführen. Wie bereits erwähnt, war dies aufgrund der Unterschiede zwischen dem endogenen bakteriellen Synthasen und orthologen archeal Synthase, die sich gegenseitig nicht erkennen kann. Schultz nachträglich erweitert die genetischen Codes von verschiedenen Organismen, so dass der genetisch kodierten Einbau von mehr als 70 nichtnatürliche Aminosäuren in Proteine. Unnatürlichen Aminosäuren durch Schultz in Proteine ​​eingebaut sind Schweratomhaltigen Aminosäuren zu röntgenkristallographische Studien zu erleichtern; Aminosäuren mit neuartigen sterischen / Verpackung und elektronischen Eigenschaften; Photo Aminosäuren, die verwendet werden können, um Protein-Protein-Interaktionen in vitro oder in vivo zu untersuchen; Keto, Acetylen, Azid und Boronat enthaltenden Aminosäuren, die verwendet werden können, um wahlweise die Einführung einer großen Anzahl von biophysikalischen Sonden, Tags und neue chemische funktionelle Gruppen in Proteinen in vitro oder in vivo; Redox-aktiven Aminosäuren zu sondieren und zu modulieren Elektronentransfer; photoaktivierbaren und photoisomerisierbare Aminosäuren biologische Prozesse, um mit Licht zu; Metallbindungs ​​Aminosäuren für die Katalyse und metallionensensitiven; Aminosäuren, fluoreszierenden oder Infrarot aktive Seitenketten an die Proteinstruktur und Dynamik Sonde enthält; α-Hydroxysäuren und D-Aminosäuren als Sonden Rückgratkonformation und Wasserstoffbrücken-Wechselwirkungen; und sulfatierten Aminosäuren und Mimetika von phosphorylierten Aminosäuren als Sonden von posttranslationalen Modifikationen.

Gerichtete Evolution

Die orthologen Reihe von Synthetase und tRNA kann dann mutiert und durch gerichtete Evolution gescreent, um die tRNA mit einem anderen, auch Roman, Aminosäuren zu berechnen. Mutationen an das Plasmid das Paar enthalten, durch fehleranfällige PCR oder durch degenerierte Primer für die aktive Stelle der Synthetase eingeführt werden. Selektion wird mehrere Runden von einem zweistufigen Prozess, bei dem das Plasmid in Zellen, die Chloramphenicolacetyltransferase mit einem vorzeitigen Amber-Codon überführt. In Anwesenheit von toxischen Chloramphenicol und dem nicht-natürliche Aminosäure, werden die überlebenden Zellen das Amber-Codon mit der orthogonalen tRNA entweder mit der Standard-Aminosäuren oder der nicht-natürlichen ein aminoacyliert außer Kraft gesetzt haben. So entfernen Sie das ehemalige, das Plasmid in Zellen mit einem Barnase-Gen mit einem vorzeitigen Amber-Codon, aber ohne die nicht-natürliche Aminosäure eingeführt, die Beseitigung aller orthogonalen Synthasen, die nicht ausdrücklich anerkennen, die nicht-natürliche Aminosäure. Zusätzlich zur Umkodierung der tRNA zu einem anderen Codon, können sie mutiert, um ein Vier-Basen-Codon zu erkennen, so dass zusätzliche freie Codierungsmöglichkeiten werden. Die nicht-natürliche Aminosäure, als Ergebnis führt diverse physikochemische und biologische Eigenschaften aufweisen, um als ein Werkzeug verwendet, um die Proteinstruktur und -funktion zu erforschen, oder sich auf neue oder verbesserte Protein für praktische Zwecke zu schaffen.

Vielfalt

Die orthogonalen Paare von tRNA-Synthetase und die für einen Organismus funktionieren möglicherweise nicht für andere arbeiten, wie der Synthetase kann Fehl aminoacyliert endogenen tRNAs oder der tRNA Fehl aminoacyliert sich durch eine endogene Synthetase sein. Als Ergebnis werden die Sätze zu den Erstellungsdatum unterscheiden zwischen Organismen.

Orthogonalen Sätzen in E. coli

  • tRNA-TyrRS-Paar der archaeon Methanococcus jannaschii
  • tRNA-LysRS Paar aus der archaeon Pyrococcus horikoshii
  • tRNA-GluRs Paar aus Methanosarcina mazei
  • Leucyl-tRNA-Synthetase aus Methanobacterium thermoautotrophicum und eine Mutante leucyl tRNA aus Halobacterium sp
  • tRNA-PylRS Paar aus der archaeon Methanosarcina barkeri und Methanosarcina mazei

Orthogonalen Sätzen in Hefe

  • tRNA-TyrRS-Paar aus Escherichia coli
  • tRNA-LeuRS Paar aus Escherichia coli
  • tRNA aus menschlichen und GlnRS aus Escherichia coli
  • tRNA-PylRS Paar aus der archaeon Methanosarcina barkeri und Methanosarcina mazei

Orthogonalen Sätzen in Säugerzellen

  • tRNA-TyrRS-Paar aus Bacillus stearothermophilus
  • modifizierten tRNA-TrpRS Paar von Bacillus subtilis trp
  • tRNA-LeuRS Paar aus Escherichia coli
  • tRNA-PylRS Paar aus der archaeon Methanosarcina barkeri und Methanosarcina mazei

Unnatürlichen Basenpaar

Eine unnatürliche Basenpaar ist eine Untereinheit der DNA konstruiert, die in einem Labor erstellt wird und nicht in der Natur vorkommen. Eine Demonstration der UBPs wurden in vitro von Ichiro Hirao Gruppe am RIKEN-Institut in Japan erreicht. Im Jahr 2002, einen unnatürlichen Basenpaar zwischen 2-Amino-8-Purin und Pyridin-2-on entwickelten sie, die Funktionen in vitro in Transkription und Translation für den ortsspezifischen Einbau von Nicht-Standard-Aminosäuren in Proteine. Im Jahr 2006 gründeten sie 7-Imidazopyridin und Pyrrol-2-carbaldehyd als dritte Basenpaar für die Replikation und Transkription. Danach wurde Ds und 4-2-nitropyrrol als High-Fidelity-Paar in der PCR-Amplifikation entdeckt. Im Jahr 2013 beantragte sie die Ds-Px Paar DNA-Aptamer Generation von In-vitro-Selektion und demonstriert das genetische Alphabet Expansion deutlich erweitern DNA-Aptamer Affinitäten Zielproteine.

Im Jahr 2012, eine Gruppe von amerikanischen Wissenschaftlern von Floyd Romesberg, eine chemische Biologe an der Scripps Research Institute in San Diego, Kalifornien führte, veröffentlicht, dass sein Team einen unnatürlichen Basenpaar ausgelegt. Die beiden neuen künstliche Nukleotide oder unnatürlichen Basenpaar wurden benannt d5SICS und DNAM. Mehr technisch, diese künstliche Nukleotide Lager hydrophoben Nucleobasen, verfügen über zwei kondensierten aromatischen Ringen, die eine komplexe oder Basenpaare in der DNA zu bilden. Im Jahr 2014 berichtete das gleiche Team vom Scripps Research Institute, dass sie eine Strecke von einem Plasmid mit natürlichen TA und CG-Basenpaare zusammen mit der besten Performance UBP Romesberg Labor entworfen hatte bekannt zirkuläre DNA synthetisiert und steckte ihn in die Zellen der gemeinsamen Bakterium E. coli, die erfolgreich durch mehrere Generationen repliziert die unnatürlichen Basenpaaren. Dies ist das erste bekannte Beispiel eines lebenden Organismus, die entlang einer ausgedehnten genetischen Codes an nachfolgende Generationen. Dies war teilweise durch die Zugabe eines unterstützenden Algen Gen, das ein Nukleotidtriphosphat Transporter die effizient importiert die Triphosphate sowohl d5SICSTP und dNaMTP in E. coli-Bakterien exprimiert erreicht. Dann werden die natürlichen bakteriellen Replikationswege nutzen sie, um das Plasmid, das d5SICS-DNAM genau zu replizieren.

Der erfolgreiche Einbau eines dritten Basenpaar in einen lebenden Mikroorganismus ist ein bedeutender Durchbruch auf das Ziel die Anzahl der Aminosäuren, die durch DNA kodiert werden kann, wodurch das Potential erweitert für lebende Organismen, neue Proteine ​​zu produzieren erheblich erweitert. Die künstlichen Saiten der DNA nicht für nichts zu kodieren, aber die Wissenschaftler spekulieren, sie entwickelt werden könnten, um neue Proteine, die industrielle pharmazeutische Anwendungen haben könnte herzustellen.

Praktische Anwendungen

Mit einem erweiterten genetischen Codes kann die unnatürliche Aminosäure genetisch an beliebiger Stelle in dem Protein von Interesse gerichtet werden. Die hohe Effizienz und Genauigkeit dieses Verfahrens ermöglicht eine bessere Kontrolle über die Platzierung der Änderung gegenüber Modifikation des Protein posttranslational, die im allgemeinen alle Aminosäuren des gleichen Typs wie die Thiolgruppe von Cystein Ziel und die Aminogruppe von Lysin. Außerdem ermöglicht eine erweiterte genetische Code Modifikationen in vivo durchgeführt werden. Die Fähigkeit, ortsspezifisch direkten Labor synthetisierte chemische Gruppierungen in Proteine ​​ermöglicht viele Arten von Studien, die sonst sehr schwierig sein würde, wie zum Beispiel:

  • Sondieren Proteinstruktur und Funktion: Durch die Verwendung von Aminosäuren mit leicht unterschiedlicher Größe, wie o-Methyltyrosin oder dansylalanine anstelle von Tyrosin und durch Einsetzen genetisch codierte Reporter-Einheiten in ausgewählte Proteinstellen können chemische Informationen über die Struktur und die Funktion des Proteins bestimmt werden.
  • Identifizierung und Regulierung Proteinaktivität: Durch die Verwendung von photoaktivierbaren Aminosäuren, kann die Proteinfunktion "geschaltet" werden ein oder aus durch Beleuchtung des Organismus.
  • Ändern der Wirkungsweise eines Proteins: Man kann mit dem Gen für ein Protein, die eine bestimmte DNA-Sequenz bindet und die durch Einführen eines chemisch aktiven Aminosäure in der Bindungsstelle zu starten, wandelt es in ein Protein, das die DNA und nicht schneidet als verbindlich ist.
  • Die Verbesserung der Immunogenität und die Überwindung der Selbsttoleranz: Durch den Austausch strategisch gewählten Tyrosinen mit p-Nitro Phenylalanin kann ein toleriert Selbst Protein immunogen gemacht werden.
  • Selektive Zerstörung ausgewählter Zellkomponenten: Verwendung eines erweiterten genetischen Codes durch unnatürliche, destruktiv chemischen Resten in Proteinen, die spezifische zelluläre Zielkomponenten eingearbeitet werden.

New Organismen mit erweiterten genetischen Codes

Im Schultz Labor wurde ein bakterieller Organismus erzeugt worden, die eine neue, zuvor nicht-natürlichen Aminosäure vom basischen Kohlenstoffquellen biosynthetisiert und schließt diese Aminosäure in ihrer genetischen Codes. Dies ist das erste Beispiel für die Schaffung einer autonomen einundzwanzig Aminosäuren-Organismus.

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