Epigenomics

Epigenomics ist die Lehre von der Gesamtheit der epigenetische Modifikationen an der Erbsubstanz einer Zelle, wie das Epigenom bekannt. Das Feld ist analog zu der Genomik und Proteomik, der die Untersuchung des Genoms und Proteom einer Zelle sind. Epigenetische Modifikationen sind reversible Modifikationen an DNA oder Histone einer Zelle, die die Genexpression beeinflussen, ohne die DNA-Sequenz. Zwei der am meisten dadurch epigenetische Modifikationen sind DNA-Methylierung und Histon-Modifikation. Epigenetische Modifikationen spielen eine wichtige Rolle in der Genexpression und Regulation und sind in zahlreichen zellulären Prozessen wie bei der Differenzierung / Entwicklung und Tumorentstehung beteiligt. Die Studie der Epigenetik auf globaler Ebene wurde durch die Anpassung der genomischen Assays mit hohem Durchsatz und ermöglicht wurde erst vor kurzem.

Einführung in die Epigenetik

Die Mechanismen, die phänotypische Plastizität, oder die Fähigkeit einer Zelle, um seinen Zustand als Reaktion auf Reize zu ändern, sind seit langem Gegenstand der Forschung. Die traditionelle zentrale Dogma der Biologie, dass die DNA von einer Zelle an RNA, die an Proteine, die die zelluläre Prozesse und Funktionen übersetzt wird, transkribiert. Ein Paradoxon besteht jedoch, daß Zellen weisen unterschiedliche Reaktionen in unterschiedlichen Stimuli und Zellen teilen identische Sätze von DNA wie in multizellulären Organismen können eine Vielzahl von verschiedenen Funktionen und Phänotypen haben. Klassische Ansichten wurden phänotypische Variation, um Unterschiede in der primären DNA-Struktur es durch abweichende Mutation oder eine vererbte Allel-Sequenz zugeschrieben werden. Während dies getan einige Aspekte der Variation erläutern, erklärt es nicht, wie eng koordiniert und reguliert zelluläre Antworten, wie Differenzierung, werden durchgeführt.

Eine weitere mögliche Quelle der Zellplastizität ist durch die Regulierung der Genexpression, so daß, während zwei Zellen nahezu identischen DNA haben, die differentielle Expression bestimmter Gene führt Variation. Forschung hat gezeigt, dass die Zellen der Lage sind, die Regulierung der Genexpression in verschiedenen Phasen: die Transkription von mRNA, die Verarbeitung und den Transport als auch bei der Proteintranslation, posttranslationale Prozessierung und Abbau. Regulatorische Proteine, die an DNA, RNA zu binden, und / oder Proteine ​​sind wichtige Effektoren in diesen Prozessen und Funktion mit positiv oder negativ Regulation spezifischer Proteinebene und Funktion in einer Zelle. Und während die DNA-Bindung Transkriptionsfaktoren stellen einen Mechanismus zur gezielten Steuerung von zellulären Antworten, ist auch ein Modell, bei dem DNA bindenden Transkriptionsfaktoren sind die alleinigen Regulator für Genaktivität unwahrscheinlich. Beispielsweise in einer Studie von somatischen Zellkerntransfer, wurde gezeigt, dass stabile Eigenschaften Differenzierung bleiben, nachdem der Kern auf eine neue zelluläre Umgebung übertragen, was darauf hindeutet, dass eine stabile und vererbbare Mechanismus der Genregulation in der Aufrechterhaltung der beteiligten differenzierten Zustand in Abwesenheit der DNA-bindende Transkriptionsfaktoren.

Mit dem Befund, dass die DNA-Methylierung und Histon-Modifikationen sind stabil, vererbbar sowie reversible Prozesse, die die Genexpression beeinflussen, ohne dabei DNA Primärstruktur wurde ein Mechanismus für die beobachteten Schwankungen in der Zell Genexpression bereitgestellt. Diese Änderungen wurden epigenetische "oben auf" genetisches Material "DNA" bezeichnet, von epi. Die Mechanismen, die epigenetische Modifikationen sind komplex, aber durch das Aufkommen von Hochdurchsatz-Sequenzierung Technologie, die sie sind jetzt immer besser verstanden.

Epigenetics

Genom-Modifikationen, die Genexpression, die nicht zur Änderung des primären DNS-Sequenz zugeschrieben werden kann zu ändern, und dass vererbbar sind mitotisch und meiotisch werden als epigenetische Modifikationen eingestuft. DNA-Methylierung und Histon-Modifikationen zählen zu den am besten charakterisierten epigenetische Prozesse.

DNA-Methylierung

Die erste epigenetische Modifikation in die Tiefe zu charakterisieren war die DNA-Methylierung. Wie der Name schon sagt, ist die DNA-Methylierung die Verfahren, mit dem eine Methylgruppe an DNA zugegeben. Die für diese Reaktion katalysieren verantwortlichen Enzyme sind die DNA-Methyltransferasen. Während der DNA-Methylierung stabil und vererblich ist, kann es durch eine antagonistische Gruppe von Enzymen, die DNA-de-Methylasen bekannt umgekehrt werden. In Eukaryonten wird die Methylierung am häufigsten auf dem Kohlenstoff 5-Position von Cytosin-Reste benachbart zu Guanin gefunden, sogenannte CpG Dinukleotide. DNA-Methylierungsmuster variieren stark zwischen den Arten und auch innerhalb der gleichen Organismus. Die Nutzung der Methylierung unter Tieren ist ganz anders; mit Wirbeltieren die höchste 5mC und Wirbellosen eher moderaten 5mC aufweisen. Einige Organismen wie Caenorhabditis elegans nicht nachgewiesen worden, um 5mC noch einen herkömmlichen DNA-Methyltransferase haben; Dieses würde vorschlagen, dass andere anders als DNA-Methylierungs-Mechanismen sind ebenfalls beteiligt.

Innerhalb eines Organismus, kann die DNA-Methylierung Ebenen variieren auch während der Entwicklung und nach Regionen. Zum Beispiel in der Maus Urkeimzellen, tritt eine genomweite De-Methylierung auch; durch Implantation Stufe Methylierung Ebenen wieder in ihre vorherige somatischen Ebenen. Wenn DNA Methylierung an Promotorregionen auftritt, werden die Stellen der Transkriptionsinitiation, hat es die Wirkung der Unterdrückung der Genexpression. Dies steht im Gegensatz zu nicht-methylierten Promotorregionen, die mit aktiv exprimierten Genen assoziiert sind.

Der Mechanismus, durch DNA-Methylierung reprimiert Genexpression ist ein mehrstufiger Prozess. Die Unterscheidung zwischen methylierten und unmethylierten Cytosin wird durch spezifische DNA-bindende Proteine ​​durchgeführt. Bindung dieser Proteine ​​rekrutieren Histondeacetylasen Enzym, das Chromatin zu initiieren Umgestaltung derart, daß die DNA zu weniger zugänglich Transkriptionsmaschinerie, wie RNA-Polymerase wirksam Unterdrückung der Genexpression.

Histonmodifikationen

In Eukaryonten wird die genomische DNA in Protein-DNA-Komplexen als Chromatin gewickelt. Histone, die die am weitesten verbreitete Art von Protein in Chromatin zu finden sind, funktionieren, um die DNA zu kondensieren; Die positive Nettoladung auf Histone erleichtert ihre Bindung an DNA, das negativ geladen ist. Die Grund- und Wiederholungseinheiten von Chromatin, Nukleosomen, bestehen aus einem Oktamer von Histon-Proteinen und einem 146 bp Länge der DNA umwickelt. Nukleosomen und die DNA-Verbindungs ​​bilden eine 10 nm Durchmesser Chromatinfaser, die ferner kondensiert sein kann.

Chromatin Verpackung der DNA in Abhängigkeit von der Zellzyklusstadium und von lokalen DNA-Region ab. Das Ausmaß, in dem Chromatin kondensiert ist mit einem bestimmten Transkriptionszustand zugeordnet. Unverpackt oder lose Chromatin ist transkriptionell aktiv als dicht verpackt Chromatin, weil sie besser zugänglich zu Transkriptionsmaschinerie ist. Durch Umbau Chromatinstruktur und die Änderung der Dichte der DNA-Verpackung können die Genexpression so moduliert werden.

Chromatin-Remodeling erfolgt über posttranslationale Modifikationen der N-terminalen Enden des Kerns Histon-Proteine. Die kollektive Gruppe von Histon-Modifikationen in einer bestimmten Zelle wird als Histon-Code bekannt. Viele verschiedene Arten von Histonmodifikation sind bekannt, einschließlich: Acetylierung, Methylierung, Phosphorylierung, Ubiquitinierung, SUMO, ADP-Ribosylierung, Deaminierung und Prolin Isomerisierung; Acetylierung, Methylierung, Phosphorylierung und Ubiquitinierung in Genaktivierung in Verbindung gebracht in der Erwägung, Methylierung, Ubiquitinierung, SUMOylierung, Desaminierung und Prolin Isomerisierung in Genrepression Verbindung gebracht. Man beachte, dass verschiedene Modifikationen Typen, einschließlich Methylierung, Phosphorylierung und Ubiquitinierung kann mit verschiedenen Transkriptions Zustände abhängig von der spezifischen Aminosäure am Histon modifiziert zugeordnet werden. Darüber hinaus wird die DNA-Region, wo Histonmodifikationen tritt auch unterschiedliche Effekte hervorzurufen; ein Beispiel ist die Methylierung des 3. Kern Histon am Lysinrest 36. Wenn H3K36 tritt in den kodierenden Abschnitten eines Gens, mit Gen-Aktivierung assoziiert ist aber das Gegenteil festgestellt wird, wenn es innerhalb der Promotorregion.

Histon-Modifikationen die Genexpression durch zwei Mechanismen: durch Unterbrechung des Kontakts zwischen Nukleosomen und durch die Einstellung von Chromatin-Remodeling-ATPasen. Ein Beispiel des ersten Mechanismus tritt bei der Acetylierung von Lysin terminalen Schwanz Aminosäuren, die durch Histonacetyltransferasen katalysiert wird. HATs Teil eines Multiproteinkomplexes, der Chromatin rekrutiert wird, wenn Aktiva um DNA-Bindungsstellen binden. Acetylierung effektiv neutralisiert die Grundgebühr für Lysin, das bei der Stabilisierung Chromatin durch ihre Affinität für negativ geladene DNA beteiligt war. Acetylierte Histone bevorzugen daher die Dissoziation von Nukleosomen und damit Abwickeln von Chromatin kann auftreten. Unter einer losen Chromatin Zustand ist DNA besser zugänglich zu Transkriptionsmaschinerie und damit Ausdruck ist aktiviert. Der Prozess kann durch die Entfernung von Histon-Acetyl-Gruppen durch Deacetylasen umgekehrt werden.

Das zweite Verfahren beinhaltet die Rekrutierung von Chromatin-Remodeling-Komplexe, die durch die Bindung von Molekülen zu entsprechenden Aktivator Enhancerregionen. Die Nukleosomen-Remodeling-Komplexen neu positionieren Nukleosomen durch mehrere Mechanismen, Aktivieren oder Deaktivieren Zugänglichkeit von Transkriptionsmaschinerie an DNA. Der SWI / SNF-Komplex-Protein in Hefe ist ein Beispiel eines Chromatin-Remodeling-Komplexes, der die Expression von vielen Genen durch Chromatin-Remodeling regelt.

Verhältnis zu anderen genomischen Felder

Epigenomics teilt viele Gemeinsamkeiten mit anderen Genomik Felder, sowohl in Methodik und in seiner abstrakten Zweck. Epigenomics versucht, auf einer globalen Ebene, ähnlich wie bei der Untersuchung des kompletten Satz von DNA in der Genomik und der Gesamtheit der Proteine ​​in einer Zelle in der Proteomik identifizieren und zu charakterisieren epigenetische Modifikationen. Die Logik hinter der Durchführung epigenetische Analysen auf globaler Ebene ist, dass Rückschlüsse über epigenetische Modifikationen, die sonst nicht möglich wäre, durch die Analyse von spezifischen Loci werden. Wie in den anderen Bereichen Genomik, setzt Epigenomics stark auf Bioinformatik, die die Disziplinen der Biologie, Mathematik und Informatik kombiniert. Doch während epigenetische Modifikationen war bekannt und untersucht seit Jahrzehnten, ist es durch diese Fortschritte in der Bioinformatik-Technologie, die erlaubt haben Analysen auf globaler Ebene. Viele aktuelle Techniken noch älteren Methoden ziehen oft Anpassung an genomischen Assays, wie im nächsten Abschnitt beschrieben wird.

Epigenomics Methoden

Histonmodifikationen Assays

Die zellulären Prozesse der Transkription, DNA-Replikation und DNA-Reparatur betreffen die Wechselwirkung zwischen genomischer DNA und Kernproteine. Es war bekannt, dass bestimmte Regionen innerhalb Chromatin waren sehr anfällig für DNAse I Verdauung, die spaltet DNA in einem niedrigen Sequenzspezifität Weise. Solche hypersensitive Stellen wurden gedacht, transkriptionell aktiven Bereiche, wie sie durch ihre Verbindung mit der RNA-Polymerase und Topoisomerasen I und II zeigt.

Es ist jetzt, dass Sensibilität für DNAse I Bereiche entsprechen Regionen von Chromatin mit losen DNA-Histon-Vereins. Hypersensitiven Stellen am häufigsten stellen Promo Regionen, die für die DNA erfordern für DNA-Bindungstranskriptionsmaschinerie Funktion zugänglich sein.

ChIP-Chip-und Chip-Seq

Histon-Modifikation wurde zum ersten Mal auf einem genomweiten Ebene durch die Kopplung von Chromatin-Immunopräzipitation Technologie mit DNA-Microarrays erkannt, genannt Chip Chip. Statt jedoch die Isolierung einer DNA-bindenden Transkriptionsfaktors oder Enhancer Protein durch Chromatin-Immunpräzipitation, die Proteine ​​von Interesse sind, werden die modifizierten Histonen selbst. Erste, Histone sind vernetzt, um DNA in vivo durch leichte chemische Behandlung. Die Zellen werden lysiert nächsten, so dass für das Chromatin zu extrahierenden und fragmentierten entweder durch Ultraschallbehandlung oder Behandlung mit einem nicht-spezifischen Restriktionsenzym. Modifikation spezifischer Antikörper wiederum werden verwendet, um die DNA-Histon-Komplexen immunpräzipitieren. Folgende Immunpräzipitation wird die DNA aus den Histonen, über PCR amplifiziert und mit einer fluoreszierenden Markierung markiert, gereinigt. Der letzte Schritt beinhaltet die Hybridisierung von markierten DNA sowohl immunpräzipitierten DNA und auf einem Microarray, die immobilisierte gDNA nicht immunpräzipitiert. Analyse der relativen Signalintensität ermöglicht, dass die Stellen von Histonmodifikation zu bestimmen.

ChIP-Chip wurde ausgiebig genutzt, um die globalen Histonmodifikationen Muster der Hefe zu charakterisieren. Aus diesen Studien wurden die Rückschlüsse auf die Funktion der Histon-Modifikationen vorgenommen werden; , dass die Transkriptionsaktivierung oder Repression wurde mit bestimmten Histon-Modifikationen und Regionen verbunden sind. Während dieses Verfahren wirksam war eine nahezu vollständige Abdeckung der Hefe epigenome, ist seine Verwendung in größeren Genomen wie Menschen begrenzt.

SAGE:: serielle Analyse der Genexpression, PET: Paired-End-Sequenzierung Doppelmarker und neuerdings auch der nächsten Generation Sequenzierung, um Histon-Modifikationen auf einem wirklich Genomebene zu untersuchen, wurden andere Hochdurchsatzverfahren mit dem Chromatin-Immunopräzipitation, und zwar gekoppelt. ChIP-seq folgt dem gleichen Protokoll für Chromatinimmunpräzipitation aber statt Amplifikation gereinigter DNA und die Hybridisierung an einen Mikroarray werden die DNA-Fragmente direkt unter Verwendung der nächsten Generation parallel Resequenzierung sequenziert. Es hat sich als ein effektives Verfahren für die Analyse der globalen Histonmodifikation Muster und Protein-Zielstellen, wodurch eine höhere Auflösung als frühere Verfahren ist.

DNA-Methylierung Tests

Techniken zur Charakterisierung eines primären DNS-Sequenzen nicht direkt an Methylierungsassays angewandt werden. Beispielsweise wenn DNA wurde in PCR oder bakteriellen Klonen amplifiziert, das Methylierungsmuster nicht kopiert und damit die Information verloren geht. Die DNA-Hybridisierungstechnik in der DNA-Assays verwendet werden, bei dem radioaktiven Sonden wurden verwendet, zu kartieren und zu DNA-Sequenzen zu identifizieren, konnte nicht verwendet werden, um zwischen methylierten und nicht-methylierten DNA zu unterscheiden.

Restriktionsendonuklease-basierte Verfahren

Nicht genomweite Ansätze

Die frühesten Methylierung Nachweisassays verwendet Methylierung Modifizierung empfindlich Restriktionsendonukleasen. Die genomische DNA wurde sowohl mit methylierungssensitiven Restriktionsenzymen und unempfindlich gegen die Anerkennung der gleichen Restriktionsstelle verdaut. Die Idee ist, dass, wenn der Standort methylierten, konnte nur die Methylierung unempfindliche Enzyms an dieser Position zu spalten. Durch Vergleichen Restriktionsfragmentgrößen von methylierungssensitiven Enzym zu denen des Methylierungsunempfindlichen Enzym erzielt wird, war es möglich, den Methylierungsmuster der Region zu bestimmen. Dieser Analyseschritt wurde durch Amplifizieren der Restriktionsfragmente mittels PCR, trennt sie durch Gelelektrophorese und deren Analyse mittels Southern-Blot mit den Sonden für den interessierenden Bereich) durchgeführt.

Diese Technik wurde verwendet, um die DNA-Methylierung Modifikationsmuster im menschlichen Erwachsenen und Hämoglobin-Genloci zu vergleichen. Unterschiedlichen Bereichen des Gens waren bekannt, in verschiedenen Stadien der Entwicklung exprimiert wird. Konsistent mit einer Rolle von DNA-Methylierung in Genrepression, Regionen, die mit einem hohen Grad der DNA-Methylierung assoziiert wurden, die nicht aktiv exprimiert.

Diese Methode wurde für Studien zur globalen Methylierungsmuster, oder "Methyloms 'geeignet begrenzt. Selbst innerhalb spezifischer Loci es war nicht ganz repräsentativ für die tatsächliche Methylierungsmuster als nur die Restriktionsstellen mit entsprechenden Methylierung empfindlich und unempfindlich Einschränkung Assays könnte nützliche Informationen liefern. Weitere Komplikationen können entstehen, wenn unvollständige Verdauung von DNA durch Restriktionsenzyme erzeugten falsch negative Ergebnisse.

Genomweite Ansätze

DNA-Methylierungs-Profiling in großem Umfang wurde erst durch die Beschränkung Mark Genome Scanning-Technik. Wie die locusspezifische DNA Methylierungs-Assay wird die Technik identifiziert methylierte DNA über ihre Verdauung Methylierung empfindlichen Enzyme. Es war jedoch der Einsatz von zweidimensionalen Gelelektrophorese, die in größerem Umfang charakterisiert werden erlaubt.

Allerdings war es nicht bis zum Aufkommen der Mikroarray und Next Generation Sequencing-Technologie, wenn wirklich eine hohe Auflösung und genomweite DNA-Methylierung möglich wurde. Wie bei RLGS wird die Endonuklease-Komponente in dem Verfahren zurückgehalten, aber es wird zu neuen Technologien verbunden. Ein solcher Ansatz ist die differentielle Methylierung Hybridisierung, bei dem ein Satz von genomischer DNA mit Methylierungs-sensitive Restriktionsenzymen und eine parallele Reihe von DNA nicht verdaut. Beide Sätze von DNA werden anschließend verstärkt und jeweils mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert und in Zwei-Farben-Array-Hybridisierung verwendet. Das Niveau der DNA-Methylierung an einer bestimmten Loci durch die relativen Intensitätsverhältnissen der beiden Farbstoffe bestimmt. Anpassung des Next Generation Sequencing, um DNA-Methylierungs-Assay bietet mehrere Vorteile gegenüber Array-Hybridisierung. Sequenz-basierte Technologie bietet eine höhere Auflösung, um spezifische DNA-Methylierung Allel kann an größeren Genomen geführt werden kann und keine Erzeugung von DNA-Mikroarrays, die Anpassung aufgrund CpG Dichte richtig funktionieren erfordern erfordern.

Bisulfit-Sequenzierung

Bisulfit-Sequenzierung beruht auf der chemischen Umwandlung von methylierte Cytosine ausschließlich, so dass sie durch Standard-DNA-Sequenzierungstechniken identifiziert werden. Natriumbisulfat und alkalische Behandlung tut dies durch die Umwandlung von nicht methylierten Cytosin in Uracil, während methyliertes Cytosin unverändert. Anschließende Amplifikation und Sequenzierung der unbehandelten DNA und Natriumbisulfit behandelter DNA ermöglicht methylierten Standorten identifiziert werden. Bisulfit-Sequenzierung, wie die traditionellen Beschränkung basierte Methoden, wurde historisch auf Methylierungsmuster von spezifischen Genorten beschränkt, bis ganze Genom-Sequenzierung Technologien zur Verfügung standen. , Im Gegensatz zu traditionellen Beschränkung basierte Methoden, Bisulfit-Sequenzierung bereitgestellt Allerdings Auflösung auf einem Nukleotidebene.

Einschränkungen der Bisulfit-Technik sind der unvollständigen Umwandlung von Cytosin in Uracil, die eine Quelle von Fehlalarmen ist. Ferner Bisulfit-Behandlung führt auch DNA-Abbau und erfordert einen zusätzlichen Reinigungsschritt, um das Natriumbisulfit entfernen.

Next-Generation-Sequenzierung ist in Ergänzung der Bisulfit-Sequenzierung in genomweiten Methylierungsanalyse gut geeignet. Während dies ermöglicht jetzt Methylierungsmuster auf der höchsten Auflösung möglich ist, auf der Einzel-Nukleotid-Ebene bestimmt werden, Herausforderungen noch in der Montageschritt wegen der reduzierten Sequenzkomplexität in Bisulfit-behandelte DNA bleiben. Erhöhungen der Leselänge zu suchen, um dieser Herausforderung zu begegnen, so dass für whole genome shotgun Bisulfit-Sequenzierung durchgeführt werden. Die WGBS Ansatz mit einem Illumina Genome Analyzer-Plattform und hat bereits in Arabidopsis thaliana umgesetzt.

Direktnachweis

Polymerase Empfindlichkeit im Einzelmolekül-Sequenzierung in Echtzeit ermöglichte es Wissenschaftlern, um epigenetische Markierungen direkt zu erfassen, wie Methylierung, wie die Polymerase entlang der DNA-Molekül wird sequenziert. Mehrere Projekte haben die Fähigkeit, genomweite epigenetische Daten in Bakterien zu sammeln demonstriert.

Theoretische Modellansätze

Erste mathematische Modelle für unterschiedliche Nukleosomen Staaten zu beeinträchtigen Genexpression wurden in den 1980er Jahren eingeführt. Später wurde diese Idee fast vergessen, bis der experimentelle Nachweis hat eine mögliche Rolle von kovalenten Histonmodifikationen als epigenetischen Code angezeigt. In den nächsten Jahren wurden Hochdurchsatz-Daten in der Tat aufgedeckt die Fülle der epigenetische Modifikationen und ihre Beziehung zu Chromatin Funktionieren die neue theoretische Modelle für das Auftreten motiviert hat, die Erhaltung und Änderung dieser Muster ,. Diese Modelle werden in der Regel im Rahmen von eindimensionalen Gitter Ansätze formuliert.

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